核酸固相合成原理（一）發(fā)表時(shí)間：2024-08-06 18:08 SYNTHESIS 核酸固相合成原理（一） Nucleic acid synthesis I 核酸的合成主要有生物法合成和化學(xué)法合成兩大類方法。生物法合成是以三磷酸核苷（NTP）作為原料，以互補(bǔ)鏈作為模板，在核酸聚合酶的作用下進(jìn)行聚合來制備核酸?；瘜W(xué)法合成是以核苷的亞磷酰胺單體作為原料，在載體上固相合成來實(shí)現(xiàn)的。固相合成的基本原理（如圖1）所示。  圖1. 核酸的固相合成原理 核苷亞磷酰胺的典型化學(xué)結(jié)構(gòu)（如圖2）所示，其以核苷作為基本單元，在其5’端羥基引入4, 4’-二甲氧基三苯甲基（DMT）作為羥基的保護(hù)單元，3’端引入N,N’-二異丙胺基-O-氰乙基亞磷酰胺作為活性單元，在堿基的胺基（在脫氧腺苷dA中為6-NH2）上引入酰胺鍵，來避免胺基參與過多的副反應(yīng)。  圖2. 脫氧核苷亞磷酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)(以脫氧腺苷dA為例) 化學(xué)法合成一般需要再固相載體上進(jìn)行，固相載體主要有多孔玻璃微球（controlled pore glass, CPG）和聚苯乙烯（polystyrene, PS）微球兩大類。CPG 是一類具有大量孔道的硅基材料（如圖3所示），需要在其表面上進(jìn)行化學(xué)修飾才可以用于核酸的固相合成。CPG 具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，適用于各種規(guī)模的核酸合成。其孔徑和載量以及合成序列的長度具有直接關(guān)系，CPG 孔徑越小，負(fù)載量越高，但是僅能用于短鏈核酸的合成；CPG 孔徑越大，負(fù)載量越低，但是可以合成長鏈的核酸（表1）。PS 微球載量要遠(yuǎn)高于 CPG，載量可達(dá) 200-400 μmol/g，在合成短鏈核酸方面有著巨大的優(yōu)勢。  圖3. 多孔玻璃微球在電鏡下的孔道結(jié)構(gòu)  表1. 不同孔徑 CPG 的載量和適用范圍 第一代 CPG 上多將核苷預(yù)修飾在孔道表面，預(yù)修飾的核苷即為目標(biāo)序列的3’端的第一個(gè)核苷（如圖4）。該類修飾目前已較少使用。目前市面上的主要產(chǎn)品是通用型的修飾（如圖5），CPG 上修飾的是含有橋環(huán)或者糖環(huán)結(jié)構(gòu)的一些有機(jī)單元，在上面可以進(jìn)行任意核苷序列的合成，具有非常好的通用性。  圖4. 第一代核酸固相載體  圖5. 第二代核酸固相載體 核酸固相合成的四個(gè)階段 SYNTHESIS 脫保護(hù) Deblock/Deprotection 核酸的固相合成主要分四個(gè)合成階段，第一階段為脫保護(hù)（deblock），有時(shí)也被稱作 deprotection，該步驟使用有機(jī)酸對載體上的 DMT 單元進(jìn)行脫保護(hù)，將羥基上的 DMT 單元切除，裸露出羥基。該步驟中使用的酸主要是 3% 的三氯乙酸在二氯甲烷中的溶液，也可以使用二氯乙酸在二氯甲烷中的溶液，大規(guī)模合成時(shí)，也可以使用二氯乙酸在甲苯中的溶液。 縮合 Coupling 第二階段為縮合（coupling），該步驟將核苷亞磷酰胺單體在縮合試劑（activator）作用下和上一步裸露出來的羥基縮合，形成亞磷酸三酯。該步驟中使用的縮合試劑有四唑，5-乙硫基四唑（ETT），5-芐硫基四唑（BTT），4,5-二氰基咪唑（DCI）以及吡啶三氟乙酸鹽等。 封端 Capping 第三階段為封端（capping），該步驟將上一步?jīng)]有和核苷亞磷酰胺單體完成縮合的羥基進(jìn)行?；舛?，避免該羥基參與后續(xù)的反應(yīng)，引入雜質(zhì)。該步驟使用兩種試劑，cap A 和 cap B，其中 cap A 的主要成分為乙酸酐或異丁酸酐，溶劑為乙腈或四氫呋喃；cap B 的主要成分為1-甲基咪唑、吡啶或2,6-二甲基吡啶等有機(jī)堿，溶劑為乙腈或四氫呋喃。 氧化/硫代 Oxidation/Sulfurization 第四個(gè)階段為（oxidation/sulfurization）。在氧化步驟中，主要使用碘將化學(xué)不穩(wěn)定的亞磷酸三酯氧化為化學(xué)穩(wěn)定的磷酸三酯。在硫代步驟中，使用硫代試劑將亞磷酸三酯轉(zhuǎn)化為硫代磷酸三酯。 上述四個(gè)步驟為合成一個(gè)核苷的基本循環(huán)，當(dāng)氧化結(jié)束后，在固相載體上就完成了一個(gè)核苷酸的增長；重復(fù)這個(gè)循環(huán)，就可以得到固載在載體上的目標(biāo)核酸序列。 |
