核酸固相合成原理（二）發(fā)表時間：2024-08-06 18:07 SYNTHESIS 核酸固相合成原理（二） Nucleic acid synthesis II 核酸的固相合成是一個重復(fù)進(jìn)行的反應(yīng)，在固相載體上每連接一個核苷酸單元，都要重復(fù)四個反應(yīng)（脫保護(hù)、縮合、封端和氧化/硫代），所以，在假定每一個核苷的合成效率都一致的前提下，固相合成核酸的總收率和每個核苷酸的連接效率之間是指數(shù)倍的關(guān)系（圖1）。  圖1. 核酸的合成效率 合成總效率 = (單步合成效率)合成步驟≈核苷酸數(shù)目 因此長鏈核酸的合成得率和單步反應(yīng)效率密切相關(guān)，一般認(rèn)為 40 nt 的單鏈合成總收率在 15-20% 之間，實際單步效率 95-97%。目前市面上的核酸合成設(shè)備可以實現(xiàn) 200 nt 單鏈核酸的合成，但是實際得率并不高。 當(dāng)核酸合成完成后，需要將核酸鏈從固相載體上氨解下來（圖2中橙色部分），得到粗產(chǎn)品核酸。氨解的另外兩個作用是將核苷酸堿基上的保護(hù)基團(tuán)切除（圖2中紅色部分），以及將磷酸三酯上的氰乙基（圖2中藍(lán)色部分）切除，生成磷酸二酯鍵。氨解的條件一般是 25% 的氨水在 60 ?C 下水解 2 小時，為了加速氨解，也可以使用氨水和甲胺水溶液等體積的混合氨溶液（AMA）進(jìn)行氨解。在高通量核酸合成中，為了加快氨解的速率，也可以使用氨氣替代氨水進(jìn)行氨解，該工藝需要使用壓力設(shè)備。  圖2. 合成完畢后核酸氨解的基本原理（以脫氧腺苷dA為例） 目前應(yīng)用最多的堿基保護(hù)基團(tuán)有，苯甲?；˙z，主要用于 A 堿基保護(hù)），乙酰基（Ac，主要用于 C 堿基保護(hù)），異丁?；╥Bu，主要用于 G 堿基保護(hù)）。隨著核酸化學(xué)的發(fā)展，研究人員開發(fā)出了多種堿基上的保護(hù)基團(tuán)，來滿足不同條件下的合成需求（見表1）。其中苯氧乙?；≒ac, iPac 和 tPac 等）可用于 A，C 和 G 堿基的保護(hù)，該類保護(hù)基在室溫下即可使用氨水脫除，屬于快脫保護(hù)基團(tuán)，該類亞磷酰胺單體也被稱為 UltraMild 單體。UltraMild 單體的反應(yīng)活性與普通單體相當(dāng)，但是在執(zhí)行 Cap 操作時，需要使用專用的 Cap A 試劑。  表1. 堿基上不同結(jié)構(gòu)的保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)條件 注：APA為氨水和丙胺等體積的混合溶液。 |
