引物合成常見問(wèn)題分析及對(duì)策

擁有國(guó)際先進(jìn)的高通量DNA合成儀、專業(yè)的技術(shù)人員及成熟的合成純化方法，能及時(shí)為您提供高質(zhì)量、多種類的引物合成服務(wù)。保證一流的質(zhì)量和及時(shí)的交貨時(shí)間。同時(shí)我們擁有嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)體系，采取“控制前移”的質(zhì)量手段，通過(guò)嚴(yán)格的供應(yīng)商質(zhì)量管理體系、嚴(yán)密的生產(chǎn)過(guò)程中間控制和安全快捷的物流服務(wù)選擇等方式控制整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程，以保證產(chǎn)品質(zhì)量滿足客戶的要求。

1、 如何溶解引物？

答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前需先離心，將引物粉末收集到管底。根據(jù)說(shuō)明書上的公式計(jì)算出的體積加入去離子無(wú)菌水或10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。

溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因?yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH4-5），引物在這種條件下不穩(wěn)定。

2、 如何保存引物？

答：引物合成后，經(jīng)過(guò)一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。溶解前的引物在室溫狀態(tài)下可以長(zhǎng)期保存。溶解后的引物-20度可以長(zhǎng)期保存。如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的OD數(shù)較大，建議分裝，避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物需避光保存。DNA溶解保存液http://laochezhan.cn/product/html/?603.html

3、測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？

答：測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個(gè)堿基以下的引物，發(fā)生的概率很小，但是也會(huì)存在。您所提交引物序列一般是通過(guò)電腦直接COPY到合成儀的，我們也有一套控制辦法，預(yù)防堿基輸入錯(cuò)誤，基本不存在人工輸錯(cuò)的現(xiàn)象。

引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，合成效率最高為99%，副產(chǎn)品不可以避免。在合成過(guò)程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過(guò)程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT，導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。缺失突變，一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不徹底造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時(shí)將不能繼續(xù)參與合成。對(duì)于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補(bǔ)鏈配對(duì)，當(dāng)擴(kuò)增的產(chǎn)品被亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可能被細(xì)菌中修復(fù)系統(tǒng)補(bǔ)上了非配對(duì)的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復(fù)制和擴(kuò)增過(guò)程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護(hù)階段如果被降解，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。

目前引物突變的問(wèn)題并沒有辦法徹底解決，一些降低突變發(fā)生的頻率建議和措施還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，不能應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)。引物合成的固相合成原理都一樣，采 用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國(guó)公司提供的，所有合成服務(wù)商都會(huì)遇到類似問(wèn)題，沒有人可以超脫。

4、如果測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，您應(yīng)當(dāng)首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，核對(duì)合成序列是否和定單一致。如果確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯(cuò)，我們建議重新挑取克隆測(cè)序。根據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)，40個(gè)堿基以下的引物，測(cè)1-2個(gè)克隆就可以了；40個(gè) 以上的特別是用于全片段拼接合成的，需要多測(cè)一些。一般情況下，每個(gè)克隆突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引 物免費(fèi)重合一次，不過(guò)重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會(huì)因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問(wèn)題的幾率?；蚱唇舆^(guò)程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變 點(diǎn)不多，就多測(cè)幾個(gè)，否則就重合一下引物。

5、引物不純會(huì)有什么后果？

答：引物不純可能會(huì)導(dǎo)致：1)非特異性擴(kuò)增；2)無(wú)法用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物5'端酶切位點(diǎn)的酶切開，特別是沒有保護(hù)堿基的引物；3) 用于測(cè)序出現(xiàn)雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。

6、拿到引物后，想在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)純度，如何實(shí)現(xiàn)？

答：實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行引物純度的檢測(cè)：

使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，堿基數(shù)≤12個(gè)的引物用20%的膠，12-60個(gè)堿基的引物用16%的膠，＞60個(gè)堿基的引物用12%